Dpph Là Gì

     
Nguyên tắc của phương phápCách pha hóa chấtTiến hành làm phản ứngCông thức tính kết quảCác chú ý cơ bảnTài liệu tham khảo

NGUYÊN TẮC

Phương pháp xác định năng lực bắtgốc tự do thoải mái DPPHᐧ (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) được cải cách và phát triển bởi Blois . Phân tích này dựa trên sự biến đổi màu của hỗn hợp DPPH. DDPH﮲ là gốc tự do bền màu sắc tím, có điện tử không ghép đôi trên nguyên tử nito sinh sản thành hệ thống liên hợp điện tử. Electron tự do của phân tử nito trong DDPH﮲ khi bắt cặp với nơi bắt đầu hydro từ hóa học kháng oxyhóa làm mất đi màu sắc tím đặc thù của gốc tự do DDPH﮲ trongdung dịch methanol. Tài năng khử cội DDPH﮲ của một chất kháng oxy hóa thể hiện tại mức độ làm sút màu của dung dịch DDPH, được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang ở cách sóng λmax = 517 nm. Phụ thuộc vào đường chuẩn chỉnh xác định giá trị IC50 .

Bạn đang xem: Dpph là gì

Bạn đang xem: Dpph là gì

PHA HÓA CHẤT

1.Pha hỗn hợp DPPH

Cân 0.0056g DPPH hòa trong 5mL Methanol trong sáng → dung dịch DPPH 30mM (stock 10X), bảo vệ nhiệt độ lạnh, bọc kín đáo bằng giấy bạc.

Khi làmthí nghiệm, trộn loãng stock 10X → 1X (3mM)

2.Pha mẫu cần phân tích

Đối với chủng loại dạng rắn (cao chiết/ bột):

-Xác định dung môi nhằm hòa tan mẫu. Lấymột ít mẫu, hòa trong số dung môi không giống nhau (nước, methanol, ethanol, acetone,DMSO,… ). Quan giáp lựa lựa chọn dung môi nào có chức năng hòa tan trọn vẹn mẫu cầnphân tích. Nếu sẽ biết mẫu của chính mình hòa tan trong chất nào rồi, chúng ta có thểbỏ qua cách này.

-Hòa rã 1000 ug mẫu mã vào 1 mL dung môi, nhận được dung dịch bao gồm nồng độ 1000ppm.

-Pha loãng bậc 2 liên tục (two-foldserial dilution) thành dãy những nồng độ khác biệt và ngừng ở khoảng tầm nồng độ từ 5 –10 ppm.

Đối vớimẫu so với dạng lỏng (dịch chiết):

-Định lượng chất cần phân tích trongdịch phân tách và tùy thuộc vào chất của chúng ta là một số loại hợp hóa học gì, sẽ có những phươngpháp định lượng không giống nhau. Ví dụ, bạn có dịch phân tách từ cải bắp tím và muốn phântích hoạt tính của hợp chất anthocyanin trong dịch chiết, bạn sử dụng phươngpháp “pH Vi Sai” để xác định dịch chiết lúc đầu có các chất anthocyanin là baonhiêu ppm.

-Từ dịch phân tách ban đầu, trộn loãng bậc2 liên tục (two-fold serial dilution) thành dãy các dịch phân tách ở độ pha loãngkhác nhau (nên có tác dụng từ 7 – 10 lần trộn loãng). Ở bước này, thực hiện dung môi táchchiết mẫu mã để pha loãng mẫu.

-Từ lượng chất chất gồm trong dịch chiếtban đầu, xác minh hàm lượng chất đề xuất phân tích trong dịch tách ở mỗi bậc phaloãng.

3.Pha đối chứng

Nếu áp dụng đối hội chứng dương là vi-ta-min C, pha hàng nồng độ tự 0 → 30 ppm, sử dụng dung môi là nước(Vitamin C tan xuất sắc trong nước)

Nếu sử dụng các đối hội chứng khác, cân nặng 100 ug chất đối bệnh và hòatan trong dung môi, tiếp nối pha loãng bậc 2 về khoảng chừng nồng độ 0 – 5 ppm.

TIẾN HÀNH PHẢN ỨNG

Trong một giếng của đĩa 96 thêm lần lượt những thành phần sau:

·100 μl chủng loại phân tích/đối chứng/dung môi

·100 μl DPPH 3 milimet / methanol

→ làm phản ứng 30 phút trong tối, đo mật độ quang tại cách sóng 750nm

Bảng bố trí thí nghiệm

Mẫu phân tích

Mẫu trắng

Mẫu đối hội chứng dương

Mẫu đối chứng âm

Dung dịch DPPH

x

x

x

Mẫu phân tích

x

x

Chứng dương (Vitamin C)

x

Methanol

x

Dung môi

x

CÔNG THỨC TÍNH

Phần trăm cội tựdo DDPH﮲ được tínhtheo công thức:


*

Chú thích

SCDPPH﮲ : khả năng bắt gốctự bởi vì DDPH﮲ (%)As : Độ hấp phụ quang của chủng loại phân tíchAb : Độ hấp phụ quang của mẫu trắngAn : Độ hấp thu của mẫu mã đối triệu chứng âm

Tính quý giá IC50 của chủng loại thử và mẫu mã đối chứng phụ thuộc vào phương trình tuyến đường tính thân nồng độ cùng % hoạt tính bắt gốc thoải mái của chúng, theo cách làm sau:


*

Chú thích

IC50 : Nồng độ mẫu thử, chuẩn có thể bắt được 1/2 gốc tự do DDPH﮲a, b : theo lần lượt là độ dốc và hệ chắn của phương trình tuyến đường tính giữ nồng độ với % bắt cội tự do.

Mẫu được thựchiện lặp lại ba lần và tác dụng được màn biểu diễn dưới dạng quý giá trung bình ±SD

LƯU Ý

Có thể trộn tùy ý nồngđộ DPPHᐧ, chỉ cầnđảm bảogốcDPPHᐧ trong bội phản ứng luôn luôn dư. Tuy vậy vậy, mình không khuyến khích chúng ta pha dung dịch DPPH ởnồngđộ vượt cao, vì lúc nàymàu của hỗn hợp DPPH khôn cùng đậm, bao gồm thểkhó quan liền kề sự thayđổi của color trước với sau bội phản ứng trong một số trường hợp.

Xem thêm: Sdl Là Gì - Series Hướng Dẫn Dùng Sdl Cơ Bản

Dung dịch DPPH nhạy cảm với ánh sáng, dễ dẫn đến oxy hóa, vì vậy chúng ta không buộc phải pha vượt nhiều, nếu pha dư gồm thể bảo quản ở ánh nắng mặt trời lạnh và bọc kín giấy bội nghĩa để né ánh sáng, và thực hiện sau 1-2 ngày, không nên dùng khi đã để quá lâu hoặc quan giáp thấy màu sắc nhạt đi so với ban đầu.

Mẫu đối chứng âm là mẫu quan trọng, chúng ta nên tái diễn nhiều lần chủng loại này trong một mẻ phân tách (trên 3 lần) để rất có thể có số liệu đúng đắn nhất.

Mẫu trắng cần thiết trong ngôi trường hợp chất phân tích của người tiêu dùng có màu, đặc biệt là những hóa học có màu sắc gần giống với màu của dung dịch DPPH (anthocyanin, astaxanthin,... ). Đối với ngôi trường hợp mẫu mã không màu cùng trong suốt, các bạn cũng có thể bỏ qua mẫu trắng.

Mẫu phân tích cần được hòa tan trả toàn, giả dụ là dịch chiết thì dịch tách cần đồng bộ và không tồn tại cặn bẩn. Nếu nên thiết, các chúng ta có thể sử dụng filter 0.45 um nhằm lọc mẫu trước khi phân tích.

Dung dịch sau bội nghịch ứng nhằm đo OD đề xuất đồng nhất, không có bọt khí (dễ xẩy ra khi làm mẫu vitamin C). Vào trường thích hợp này có thể dùng đầu tip hoặc tăm nhằm khuấy nhẹ, thải trừ bọt khí.

Khi thêm những thành phần phản bội ứng vào bát 96 hoặc ống nghiệm, dung dịch DPPH rất cần được thêm sau cùng, và bảo đảm tránh ánh sáng nhiều nhất tất cả thể. Đối với đĩa 96 các chúng ta cũng có thể cố gắng thao tác nhanh. Đối cùng với ống nghiệm, các bạn có thể bọc lại bởi giấy bạc. Nhằm phản ứng ra mắt ở nới không có ánh sáng. Sau thời gian phản ứng, kết quả cần được đo ngay, không để lâu bên cạnh ánh sáng.

Phần kết quả, các chúng ta có thể nhập vào excel với tính toán bằng tay thủ công theo công thức tôi đã trình bày, hoặc rất có thể sử dụng một số trong những phần mềm thông dụng để có được hiệu quả nhanh rộng nhé. Ở đây, bản thân đề xuất một phần mềm thân quen là Graphpad Prism.

Xem thêm: Bật Mí Chế Độ Ăn Cho Trẻ 9 12 Tháng Tuổi Như Thế Nào Là Tốt Nhất

THAM KHẢO

2.Kedare SB, Singh R. Genesis and development of DPPH method of antioxidantassay. Journal of food science and technology. 2011;48(4):412-422.